Molekular Sitogenetik

Molekular Sitogenetik

Hamiləlik pozulmalarına və anormal doğuşlara səbəb ola bilən xromosom anormallıqların atadan qaynaqlanan böyük bir hissəsi sperma hasilatı mərhələsi zamanı de novo, yəni yenitörəmə şəklində baş verir.

Molekulyar sitogenetik araşdırma üçün, xromosomlar müxtəlif fluoressensiya boyaları ilə işarələnərək analiz üçün hazırlanır. Bu üsula FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) adı verilir. Xromosomlar məqsəddən asılı olaraq fərqli hissələrindən işarələnib analiz edilə bilərlər. FISH üsulunun üstünlüyü xromosomlar əldə edilmədən birbaşa hüceyrə nüvəsinə tətbiq oluna bilməsidir. Prenatal diaqnostika və implantasiya qabağı genetik diaqnostika zamanı panellər halında tətbiq edildikdə bir cəhddə 5, iki cəhddə toplam 9 xromosoma qədər (13, 16, 18, 21, 22 və 15, 17, X, Y) araşdırıla bilər.

  • FISH Analizi edilə bilən nümunələr
  • Periferik Qan
  • Döl Qanı (Körpə göbəkbağı qanı)
  • Amnion
  • CVS (Xorion Tükcüklərinin Biopsiyası)
  • Azad olunma Materialı (Uşaqsalma Materialı)
  • Toxuma, dəri biopsiyası
  • Sperma
  • Blastomer (Embrion hüceyrəsi)
  • FISH tətbiq etmələri
  • Mikrodelesiya sindromları üçün hüceyrə kulturasından xüsusi zondlarla FISH analizi (qan, dəri toxuması)
  • Prader-Willi/Angelman Sindromu
  • DiGeorge Sindromu
  • Williams Sindromu
  • Retinoblastoma
  • BCR/ABL
  • Amniotik mayedən xüsusi zondlarla FISH analizi
  • Amniotik mayedən FISH ilə sürətli aneuploidiya araşdırması (13, 18, 21, X və Y)
  • Marker xromosomlar üçün FISH analizi
  • Blastomerlərdə aneuploidiya testi və translokasiyalar üçün xüsusi zondlarla FISH analizi (İmplantasiya qabağı genetik diaqnostika)
  • Spermanın FISH analizi
  • Xüsusi zondlarla FISH analizi
  • XXY (Klaynfelter Sindromu)

Sperma FISH

Hamiləlik pozğunluqlarına və anormal doğuşlara səbəb ola bilən xromosom anormallıqların atadan qaynaqlanan böyük bir hissəsi sperma hasilatı mərhələsi zamanı de novo, yəni yenitörəmə şəklində baş verir. Anormal hallarda, spermatozoid bir və ya daha çox xromosomu artıq və ya əksik daşıya bilər (aneuploid), və ya artıq bir xromosom dəsti daşıya bilər (diploid). Bu kimi halları müəyyən edə bilmək üçün spermatozoidə FISH əməliyyatı (Fluoressensiya boyalarla araşdırma) tətbiq edilir. Bu əməliyyatda 13, 18, 21, X və Y xromosomları araşdırılır. Əgər ata namizədi translokasiya (xromosomlar arasında yeniden düzənlənmələr) daşıyıcısıdırsa bu translokasiyaya qatılan xromosomlar üçün nəzərdə tutulmuş xüsusi FISH əməliyyatı da tətbiq edilə bilər. Bu üsulla, insanın balanssız qametalarının faiz nisbəti hesablana bilər və onun yaranacaq embrionlarındakı balanslı-balanssız faizi haqqında nəticəyə gəlmək olar. 1000 ədəd spermatozoid araşdırılaraq anormal spermatozoidlərin faiz nisbəti müəyyən edilir.

Anormal Spermatozoid

İMPLANTASİYA QABAĞI GENETİK DİAQNOSTİKADA (PGD) YENİ ÜSULLAR – CGH VƏ MICROARRAY-LƏR

Süni mayalanma üsulunda embrionların həyat keyfiyyətinə təsir edən ən önəmli amillərdən biri embrionun xromosom tərkibidir. Hamiləliyin erkən dövründə baş verən uşaqsalmaların 50-60%-na xromosom pozğunluqları səbəb olur. Embrionun inkişafı və morfologiyası, çox təəssüf ki, embrionun xromosomları haqqında məlumat verə bilmirlər. Bununla bərabər süni mayalanma üsulundakı yeniliklər  sayəsində, embrionlar hamiləlik əldə edilməmişdən əvvəl xromosom pozğunluqları baxımından araşdırıla bilər. Xromosom pozğunluqlarının hamiləlik baş verməmişdən öncə test edilərək sağlam embrionların transfer edilməsi əməliyyatına “implantasiyadan əvvəl genetik diaqnostika” və ya “implantasiya qabağı genetik diaqnostika (PGD)” adlandırılır. PGD-nin gündəlik istifadəsi ilə ailənin daşıyıcı olduğu xromosom anormallıqları embrion mərhələsində müəyyən edilə bilər və sağlam uşaqların doğulması təmin edilə bilər. Bundan başqa daha çox ana yaşının yuxarı olmasından qaynaqlanan xromosom anomaliyaları, təkrar implantasiya uğursuzluğu, anomaliyalı döl tarixçəsi olan ailələrdə də sağlam və uğurlu hamiləliklər təmin oluna bilər.

PGD əməliyyatı bugünkü gündə geniş olaraq FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) üsulu ilə həyata keçirilir. FISH üsulunda xromosomlara xüsusi olaraq hazırlanmış və  ‘fluoresenssiya zondları’ adlandırılan təbii rənglərdəki müəyyən edici sistemlərdən istifadə olunur. Həyata keçirilən biopsiya nəticəsində qandan alınan hüceyrələrin xromosomlarına bu fluoresenssiya zondlarının bağlanmasından sonra bu hüceyrələrdən alınan siqnallar mikroskop vasitəsilə araşdırılır və xromosom sayı haqqında məlumat əldə edilir. FISH üsulunda istifadə oluna bilən müxtəlif rənglərdəki zondların kifayət sayda olmaması və hər bir və ya bir neçə işarələmənin müəyyən bir vaxt aparması səbəbindən bu üsulla araşdırıla bilən xromosom sayı məhdud olur. Həmçinin FISH üsulunda xromosomlara aid siqnalların üst-üstə düşməsi bu üsulun digər zəif cəhətidir.

Embrionlarda bütün xromosomların araşdırıla bilməsi üçün müxtəlif üsullardan istifadə olunur. İlk dəfə 1996-cı ildə blastomerlərdə tətbiq edilən Müqayisəli Genom Hibridizasiya (Comparative Genomic Hybridization – CGH) üsulu, hüceyrənin bütün xromosomlarının araşdırıla bilməsini təmin edir. İş prinsipi Şəkil 1-də təfsilatı ilə göstərilən CGH üsulu, FISH üsulu ilə müqayisə edildiyi zaman bir çox üstünlüklərə malikdir. Bütün xromosom ədədlərinin araşdırıla bilməsindən başqa, bir xromosom üçün bir çox təyin edicinin istifadə olunması FISH üsulu ilə müəyyən edilə bilməyəcək qədər kiçik ancaq önəmli ola biləcək bir çox pozğunluqların (xromosom üzərindəki kiçik pozğunluqlar; delesiya və ya törəmələr; duplikasiya kimi) təyin edilə bilməsinə imkan verir. Aparılan tədqiqatlar CGH üsulu ilə müəyyən olunan xromosom pozğunluqlarının 20-40%-nın FISH üsulu ilə müəyyən edilə bilməyəcəyini üzə çıxarmışdır. Həmçinin texniki olaraq tətbiq etmənin asan olması və hər mərhələdəki hüceyrələrə tətbiq edilə bilməsi üsulun digər üstünlükləri arasındadır.

CGH üsulunun implantasiya qabağı genetik diaqnostikada istifadə olunmasının qarşısındakı ən böyük əngəl, üsulun müddətinin uzun olmasına görə (4-5 gün) IVF(in vitro fertilization – süni mayalanma) əməliyyatının müddətinə uyğun gəlməməsidir. Lakin bu problem də, toxum hüceyrələrinin ilk toplandıqları gün, qütb cisimciklərinin araşdırılması ilə və ya biopsiya edilən embrionun nəticələr əldə edilənə qədər dondurulması və daha sonralar transfer edilməsi ilə aradan qaldırıla bilər.

İMPLANTASİYA QABAĞI GENETİK YOXLAMADA MİKROARRAY-LƏR:

İndiki zamanda bütün xromosomların yoxlanması üçün ən çox perspektivli üsul mokroarray-lərin istifadəsi hesab edilir. DNT microarray-ləri(mikro-ardıcıllıqları) şüşə, plastik və ya silikon kimi bərk bir səthə yapışdırılaraq ardıcıl bir şəkildə yaradılmış mikroskopik DNT ardıcıllıq nöqtəcikləridir (Şəkil 2). Bir mikroarray-də “prob” adlandırılan bu nöqtəciklərdən on minlərlə ola bilər. Bunun sayəsində eyni anda xromosomlar üzərindəki bir çox hissələrin araşdırılması mümkün olur.

Mikroarray-də istifadə olunan prob sayı FISH və CGH üsulunda istifadə oluna bilən prob sayı ilə müqayisədə daha çox olduğu üçün mikroarray-lər daha çox məlumat verici (informativ) olur. Həmçinin hibridizasiya müddətinin daha qısa olması və analiz prosesinin kompüter proqramları sayəsində daha avtomatik bir şəkildə aparılması nəticəsində xromosomlarla bağlı məlumatlar 48 saatdan daha qısa müddətdə əldə edilə bilər. Bunun sayəsində embrionlardan biopsiya ilə alınan hüceyrələrin PGD nəticələrinin, embrionların dondurulmasına ehtiyac qalmadan transfer günündən əvvəl əldə edilməsi mümkün olur. Mikroarray üsulunun istifadə olunması ilə edilən ilk klinik PGD tədqiqatında 8 xəstədən 6-sında hamiləlik əldə edilmişdir.

CGH və mikroarray-lər bu an üçün PGD sahəsində aktiv olaraq istifadə olunan və ya tətbiq olunan metodlar olmadıqlarına baxmayaraq, bu üsullar üzərində eksperimental və kliniki tədqiqatlar davam edir. Xüsusilə analiz əməliyyatının mürəkkəb olması, xərclərin tətbiq olunmaqda olan FISH üsuluna nisbətən yüksək olması kimi problemlər olmaqla bərabər bu üsullar PGD üçün perspektivlidir.